HPG/AHA蛋白合成分析方案熒光顯微鏡

介紹

L-高炔丙基甘氨酸（HPG）和L-疊氮高丙氨酸（AHA）是傳統(tǒng)35S蛋氨酸的非放射性替代品，后者在活性蛋白質(zhì)合成過(guò)程中被并入蛋白質(zhì)中，可以直接添加到細(xì)胞中。用于檢測(cè)從頭合成蛋白的基于HPG和AHA的商業(yè)試劑盒提供了很好的結(jié)果，但通常非常昂貴，并且提供了固定量的試劑，這限制了這些試劑盒的優(yōu)化或非協(xié)議使用。自組裝套件是商用套件的可行替代品，尤其是當(dāng)所有組件都可從許多供應(yīng)商處廣泛獲得時(shí)。試劑的量和點(diǎn)擊反應(yīng)條件在許多商業(yè)試劑盒之間非常相似，并且符合大量已發(fā)表的基于HPG和AHA的新合成蛋白質(zhì)檢測(cè)程序。使用所提供的方案，研究人員將能夠組裝HPG或AHA蛋白質(zhì)合成測(cè)定，這將需要很少的微調(diào)（如果有的話）。

這些具有改進(jìn)的生物相容性和檢測(cè)極限的試劑盒首先由賽默飛世爾科學(xué)公司商業(yè)化，并以Click iT®HPG和Click i T®AHA的價(jià)格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代銅螯合疊氮化物。在疊氮化物報(bào)告分子處引入銅螯合部分允許顯著增加反應(yīng)位點(diǎn)處的有效Cu（I）濃度，增強(qiáng)了反應(yīng)速率加速中的最弱環(huán)節(jié)，大大提高了用于分析細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的基于HPG和AHA的測(cè)定的靈敏度和生物相容性。

所需材料

HPG（L-炔丙基甘氨酸）或AHA（L-氮雜高丙氨酸）

AZDye吡啶疊氮化物

五水合硫酸銅（II）

THPTA公司

抗壞血酸鈉

固定劑（PBS中3.7%甲醛）

滲透試劑（例如，0.5%Triton®X-100 PBS溶液）

PBS中的3%BSA（pH 7.4）

Hoechst 33342（可選）

材料準(zhǔn)備

HPG/AHA儲(chǔ)備溶液制備50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液，例如使1 mL 50 mM儲(chǔ)備溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中

AZDye Picolyl Azide儲(chǔ)備溶液在DMSO或水中制備1mM溶液。示例：要制備150µL，將整個(gè)AZDye Picolyl Azide試劑盒溶于150µL DMSO或水中

銅催化劑（25 mM CuSO4，62.5 mM THPTA）溶液稱出312 mg五水合硫酸銅（II）和1.35 g THPTA，加入50 mL水，渦旋至溶解

反應(yīng)緩沖液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5。將3.02 g Tris，4.4 g NaCl溶于500 mL水中，調(diào)節(jié)pH至7.5，無(wú)菌過(guò)濾器

Hoechst 33342 10 mg/mL儲(chǔ)備溶液。將1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去離子水中

還原劑將20 mg抗壞血酸鈉溶于1.8 mL去離子水中。渦旋直至溶解。抗壞血酸鈉溶液易被氧化。我們建議始終使用新鮮制備的抗壞血酸鈉溶液

在PBS中洗滌緩沖液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g干燥die氮化鈉。用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存的無(wú)菌過(guò)濾器

1.用HPG/AHA標(biāo)記細(xì)胞

該方案基于大量基于HPG和AHA的程序的出版物，用于分析與不同類型細(xì)胞一起使用的細(xì)胞中的肽合成。優(yōu)化的HPG/AHA濃度為50μM，但可能需要根據(jù)給定的細(xì)胞類型進(jìn)行調(diào)整。生長(zhǎng)培養(yǎng)基、細(xì)胞密度、細(xì)胞類型變化和其他因素可能會(huì)影響標(biāo)記。鼓勵(lì)研究人員首先確定HPG試劑的最佳濃度以及每種細(xì)胞類型的標(biāo)記時(shí)間。

將細(xì)胞以所需的密度放置在蓋玻片上，并在額外處理前讓其恢復(fù)過(guò)夜

在DMSO或水中制備50 mM HPG或AHA溶液

用PBS清洗細(xì)胞一次，加入無(wú)蛋氨酸培養(yǎng)基，并在37°C下孵育細(xì)胞30–60分鐘，以耗盡蛋氨酸儲(chǔ)備

將所需量的HPG或AHA添加到無(wú)L-蛋氨酸培養(yǎng)基中的細(xì)胞中，以達(dá)到最佳工作HPG/AHA濃度（50μM，如果未優(yōu)化）

在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入HPG或AHA時(shí)，避免以可能破壞正常細(xì)胞循環(huán)模式的方式干擾細(xì)胞

在適合細(xì)胞類型的條件下培養(yǎng)細(xì)胞所需的時(shí)間。不同的細(xì)胞類型可能需要不同的孵育期，以便用HPG或AHA進(jìn)行最佳標(biāo)記。作為起點(diǎn)，我們建議50μM HPG或AHA持續(xù)1小時(shí)

立即進(jìn)行細(xì)胞固定和滲透

2.細(xì)胞固定和滲透

以下方案用于在PBS中使用3.7%甲醛的固定步驟，然后進(jìn)行0.5%Triton®X-100滲透步驟。也可以使用使用其他固定/滲透試劑（如甲醇和皂苷）的方案。

將每個(gè)蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)井中。為了方便加工，使用6孔板

代謝標(biāo)記后，移除培養(yǎng)基，向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室溫下孵育15分鐘

去除固定劑，用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次

取出洗滌液。向每個(gè)孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液，然后在室溫下孵育20分鐘

3.HPG/AHA檢測(cè)

注：每個(gè)蓋玻片使用500μL反應(yīng)混合物。只要剩余的反應(yīng)組分保持在相同的比例，可以使用較小的體積。

根據(jù)表1制備所需量的反應(yīng)雞尾酒。按表中所列順序添加配料。在制備后15分鐘內(nèi)使用反應(yīng)混合物。

表1

移除滲透緩沖液（步驟2.4）。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次。取出洗滌液。

向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入0.5mL反應(yīng)雞尾酒。短暫搖動(dòng)盤(pán)子，確保反應(yīng)混合物均勻分布在蓋玻片上。

避光，在室溫下孵育板30分鐘

取出反應(yīng)混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

用1mL洗滌緩沖液洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

用1mL PBS洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。

此時(shí)，樣本已準(zhǔn)備好進(jìn)行DNA染色。如果不需要DNA染色，繼續(xù)進(jìn)行成像

如果需要對(duì)樣品進(jìn)行抗體標(biāo)記，請(qǐng)按照制造商的建議進(jìn)行標(biāo)記。培養(yǎng)過(guò)程中，保持樣品免受光照。

4.DNA染色

用1mL PBS清洗每個(gè)孔。取出洗滌液。

通過(guò)稀釋Hoechst 33342 1:2000的儲(chǔ)備溶液制備1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最終濃度為5µg/mL。

1x Hoechst 33342的最終濃度范圍為2μg/mL至10μg/mL。

每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光線照射。在室溫下孵育30分鐘。

移除Hoechst 33342溶液。

用1mL PBS洗滌每個(gè)孔兩次。

取出洗滌液。

成像

標(biāo)記細(xì)胞與所有載玻片制備方法兼容

所選引用：

Dieterich，D.C.、Link，A.J.、Graumann，J.、Tirrell，D.A.和Schuman，E.M.等人（2006）。使用生物正交非經(jīng)典氨基酸標(biāo)記（BONCAT）選擇性鑒定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中新合成的蛋白質(zhì)。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊，103（25），9482-87。[PNAS]