大型共價(jià)連接熒光和金納米粒子免疫探針

FluoroNanogold™ 探針含有熒光標(biāo)記和與靶向分子共價(jià)連接的Nanogold®簇，已成功用于相關(guān)熒光和電子顯微鏡 (EM) [1]。然而，納米金很小（1.4 nm），需要銀或金增強(qiáng)才能可視化[2]。與較大的膠體金制劑相比，這會(huì)產(chǎn)生更大的尺寸變異性。銀增強(qiáng)可能會(huì)導(dǎo)致非特異性背景；銀可以通過四氧hua鋨 (OsO ₄ ) 固定進(jìn)行化學(xué)蝕刻，導(dǎo)致信號(hào)丟失[2]。我們已經(jīng)制備了用于相關(guān)顯微鏡的共價(jià)連接組合熒光探針和較大的金納米顆粒探針，可以通過電鏡直接觀察，無需自動(dòng)金相增強(qiáng)。使用自組裝涂層對(duì)直徑為 2 nm 至 40 nm 的金納米顆粒進(jìn)行穩(wěn)定和功能化，該涂層包含疏水性螯合硫醇結(jié)構(gòu)域，用于將金表面與水介質(zhì)密封，以及親水性末端官能團(tuán)（聚乙二醇，PEG），使金納米顆粒具有生物相容性。金納米粒子并實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性共價(jià)探針綴合。這提供了高穩(wěn)定性以及表面特性和共軛反應(yīng)的廣泛選擇。

5 nm 金納米顆粒的制備方法是，在增溶性非官能化硫醇和受保護(hù)的胺官能化硫醇的混合物存在下，用硼氫hua鈉直接還原金 (III) 鹽水溶液，然后使用蔗糖密度梯度 (10-30%) 進(jìn)行純化超速離心（Ti-41 轉(zhuǎn)子，26,000 rpm，45 分鐘，5 ℃；距離頂部約 4 厘米的強(qiáng)烈紅色帶包含 5 nm 金）。通過在鹽酸甲醇中脫保護(hù)制備胺功能化的金顆粒。通過與商業(yè) N-羥基琥珀酰亞胺基-(NHS) Cy-5.5 熒光染料反應(yīng)證明了特異性反應(yīng)性。該綴合物通過 Superose-12 尺寸排阻色譜進(jìn)一步純化（圖 1）。這種尺寸的不穩(wěn)定顆粒會(huì)被 0.1 M 氯化鈉沉淀，但即使在 1.0 M 氯化鈉溶液中，涂覆的顆粒仍保持分散和懸浮狀態(tài)。將它們反復(fù)離心并全重懸，不留下任何固體沉淀；對(duì)常規(guī)蛋白質(zhì)或大分子穩(wěn)定的膠體金綴合物進(jìn)行相同的處理總是會(huì)導(dǎo)致部分組分損失，形成無法重懸的不溶性沉淀。

通過將 NHS 和馬來酰亞胺活化的 5 nm 金顆粒分別與二抗分子 IgG 和 F(ab') 共價(jià)連接來制備組合 5 nm 金-二抗 -Alexa Fluor 594 綴合物。然后，NHS 修飾的 Alexa Fluor 594 染料與綴合物發(fā)生反應(yīng)。使用蔗糖密度梯度超速離心純化產(chǎn)物，然后如上所述進(jìn)行凝膠過濾。使用抗兔-F(ab')綴合物作為針對(duì)多克隆兔抗紅細(xì)胞抗體的二級(jí)探針來標(biāo)記懸浮液中的綿羊紅細(xì)胞，并使用 Nikon G-2A 濾光片組通過熒光顯微鏡觀察標(biāo)記情況（圖2）。抗小鼠 IgG 綴合物用作二級(jí)探針，與小鼠抗人 AE1/AE3 初級(jí)探針一起使用，在人扁桃體組織中產(chǎn)生清晰的細(xì)胞角蛋白染色（圖 3 ）。熒光金綴合物的相對(duì)量子產(chǎn)率為相應(yīng)商業(yè)染料標(biāo)記二抗的 22-35%。