內容

1.化學
2.液相合成
3.固相合成
3.1.中國銀行SPPS
3.2.Fmoc SPPS
4.固體支持物
4.1.聚苯乙烯樹脂
4.2.聚酰胺樹脂
5.保護團體
5.1.Fmoc保護基團
5.2.Boc保護基團
5.3.芐氧羰基(Z)基團
5.4.Alloc保護基團
5.5.平版保護基團
6.激活組
6.1.碳化二亞胺
6.2.芳香肟
7.合成長肽
8.固相肽合成的一個例子
9.參考

1.化學

肽是通過將一個氨基酸的羧基或C端偶聯到另一個氨基酸的氨基或N端而合成的。

2.液相合成

液相肽合成是肽合成的經典方法。在大多數實驗室中，它已被固相合成所取代(見下文)。然而，它在用于工業目的的肽的大規模生產中仍然有用。

3.固相合成

Merrifield固相肽合成(SPPS)導致了肽合成領域的范式轉變。這是目前實驗室以合成方式制造肽和蛋白質的方法。SPPS允許合成難以在細菌中表達的天然肽、摻入非天然氨基酸、肽/蛋白質骨架修飾以及合成由D-氨基酸組成的D-蛋白質。

小珠子用接頭處理，在接頭上可以構建肽鏈。合成珠將保持與肽的強結合，直到被試劑裂解。珠子創造了一種合成環境，在這種環境中，產生的肽鏈不會通過過濾材料，而用于產生肽鏈的試劑會通過。

重點考慮在每一步中產生高的產量。例如，如果每個步驟具有99%的產率，26個氨基酸的肽將以77%的最終產率合成，如果每個步驟是95%，它將以25%的產率合成。因此，每一種氨基酸都是以大大過量(2 ~ 10倍)添加的，并且通過一系列充分表征的試劑將氨基酸偶聯在一起是高度優化的

有兩種主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。與核糖體蛋白質合成不同，固相肽合成以C-末端到N-末端的方式進行。氨基酸單體的N-末端被這兩個基團保護，并被加到去保護的氨基酸鏈上。

自動合成器可用于這兩種技術，盡管許多研究小組繼續手動執行spp。

SPPS受到產量的限制，通常70~100個氨基酸范圍內的肽和蛋白質正在推動合成可及性的極限。合成難度也依賴于序列；典型的淀粉樣肽和蛋白質很難制造。通過使用天然化學連接將兩個肽偶聯在一起，可以獲得更長的長度，并具有定量的產量。

3.1.中國銀行SPPS

當R. B. Merrifield在1963年發明SPPS時，它是根據tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基。為了從生長的肽鏈上去除Boc，使用酸性條件(通常是純TFA)。在合成結束時，通過在氫氟酸中孵育(這可能是危險的)，從樹脂中除去側鏈保護基團和肽；由于這個原因，Boc化學通常不受歡迎。然而，對于復雜的合成，Boc是有利的。當合成對堿基敏感的非天然肽類似物(如depsi肽)時，Boc是必需的。

4.固體支持物                        

固相支持物的物理性質及其可用于的應用，隨著構建支持物的材料、交聯的量以及所用的接頭和手柄而變化。

4.1.聚苯乙烯樹脂

這是一種多功能樹脂，由于其在DCM中的溶脹最小，因此在多孔自動化肽合成中非常有用。

4.2.聚酰胺樹脂

這也是一種有用和多用途的樹脂。它似乎比聚苯乙烯膨脹得多，在這種情況下，如果孔太小，它可能不適合一些自動合成器。

5.保護團體

由于在每個合成步驟中使用過量的氨基酸來確保偶聯，在每個氨基酸未被保護的反應中，氨基酸的聚合是常見的。為了防止這種聚合，使用了保護基團。這給合成反應增加了額外的去保護階段，產生了如下的重復設計流程:

• 在去保護反應中，保護基團從尾部氨基酸中被除去

• 洗去脫保護試劑以提供清潔的偶聯環境

• 溶解在溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保護的氨基酸與偶聯劑混合，泵送通過合成柱

• 洗去偶聯試劑以提供干凈的去保護環境

目前，固相肽合成中通常使用兩種保護基團(Fmoc，Boc)。它們的不穩定性是由氨基甲酸酯基團引起的，氨基甲酸酯基團容易釋放CO2用于不可逆的解偶聯步驟。

5.1.Fmoc保護基團

Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前廣泛使用的保護基團，其通常在從氨基酸單元重復合成肽的過程中從肽的N末端除去。Fmoc的優點是它在非常溫和的堿性條件下(例如哌啶)被裂解，但在酸性條件下穩定。這使得在堿性條件下穩定的溫和的酸不穩定保護基團，例如Boc和芐基，被用于目標肽的氨基酸殘基的側鏈上。這種正交保護基策略在有機合成領域很常見。

5.3.芐氧羰基(Z)基團

另一種基于氨基甲酸酯的基團是芐氧羰基(Z)基團。它在更苛刻的條件下被去除:溴化氫/乙酸或催化氫化。今天，它幾乎用于側鏈保護。

5.4.Alloc保護基團

當需要鄰位去保護方案時，烯丙氧基羰基(alloc)保護基團通常用于保護羧酸、羥基或氨基。有時在進行樹脂上環肽形成時使用，其中肽通過側鏈官能團與樹脂連接。可以使用四(三苯基膦)鈀(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基嗎啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小時來除去alloc基團。然后，必須用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸鈉的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔細清洗樹脂。

5.5.平版保護基團

對于特殊應用，如蛋白質微陣列，使用平版印刷保護基團。這些基團可以通過曝光去除。

6.激活組

為了偶聯肽，羧基通常被活化。這對加速反應很重要。有兩種主要類型的活化基團:碳二亞胺和芳香肟。

6.1.碳化二亞胺

這些活化劑最初是被開發出來的。最常見的是二環己基碳二亞胺(DCC)和二異丙基碳二亞胺(DIC)。與羧酸反應生成高活性的O-酰基脲。在人工蛋白質合成過程中(如Fmoc固態合成儀)，C末端通常用作氨基酸單體添加的附著位點。為了增強羧酸基團的親電性，帶負電荷的氧必須首先被“活化"成更好的離去基團。DCC用于此目的。帶負電荷的氧將充當親核試劑，攻擊DCC中的中心碳。DCC暫時連接到以前的羧酸酯基團(現在是酯基團)，使得氨基(在連接的氨基酸上)對以前的C-末端(碳酰基)的親核攻擊更有效。碳二亞胺的問題是它們反應性太強，因此會導致氨基酸的外消旋化。

最新的發展省略了碳二亞胺。活性酯作為非親核陰離子(四氟硼酸鹽或六氟磷酸鹽)的脲鹽或鏻鹽引入:HBTU、HATU、PyBOP。

7.合成長肽

逐步延伸，其中氨基酸逐步依次連接，對于含有2至100個氨基酸殘基的小肽是理想的。另一種方法是片段縮合，其中肽片段被偶聯。雖然前者可以延長肽鏈而不發生外消旋化，但如果僅用于產生長肽或高極性肽，產量會下降。對于合成復雜的長肽來說，片段縮合比逐步延伸更好，但是為了防止外消旋化，必須限制它的使用。片段縮合也是不希望的，因為偶聯的片段必須大大過量，這可能是一個取決于片段長度的限制。

產生更長肽鏈的一個新進展是化學連接:未保護的肽鏈在水溶液中發生化學選擇性反應。第一個動力學控制的產物重排形成酰胺鍵。最常見的天然化學連接形式使用與末端半胱氨酸殘基反應的肽硫酯。

8.固相肽合成的一個例子

以下是使用堿不穩定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團在聚酰胺或聚苯乙烯樹脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下面概述的技術，將獲得在N-末端用乙酰基封端，在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

為手動肽合成設置玻璃器皿

手動肽合成可以在具有三通閥的燒結過濾器反應容器中完成，該三通閥通過1孔塞子安裝在1 L側臂真空燒瓶上。一個閥門用于充入氮氣，氮氣首先通過一個小的Drierite柱，然后進入反應混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個閥門用于排空過量的反應溶液，并使用真空瓶洗滌溶劑。用于固相合成的所有玻璃片應在使用前用硅烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯硅烷)處理，以避免靜電荷的積累，靜電荷的積累會使樹脂很難處理。

聚酰胺樹脂的制備

聚酰胺(PL-DMA)樹脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過夜，然后過濾，用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌，并使用苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯并三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然后可以在真空下干燥，并儲存在-15攝氏度，直到需要。

在合成前和合成過程中處理樹脂

樹脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鐘，然后瀝干。每次完成氨基酸偶聯后，還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹脂。

Fmoc-去保護

每次氨基酸偶聯后，用2×10ml 20%哌啶的DMF溶液進行Fmoc去保護，每次處理用N2攪拌10分鐘。然后用5×10毫升DMF洗滌樹脂，接著用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。

添加氨基酸

為了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹脂上開始肽合成，通過用哌啶處理樹脂來除去Fmoc基團。然后使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個氨基酸偶聯至樹脂的Fmoc-去保護的N-末端胺，或之前偶聯的氨基酸，直到樹脂對茚三酮呈陰性。

監測氨基酸偶聯的進展

氨基酸偶聯的過程可以用茚三酮或對氯醌來跟蹤。茚三酮溶液在游離伯胺的存在下變成深藍色(陽性結果)，但在其他情況下是無色的(陰性結果)。如果使用乙醛作為溶劑，在伯胺的存在下，或者如果使用丙酮，在仲胺的存在下，對-氯醌溶液將使樹脂珠變成深黑色或藍色；否則珠子保持無色或淡黃色。(測試概述如下)

茚三酮測試(1)

向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液，以及抹刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物，并在100°c下加熱5分鐘

用氯醌測試(2)

向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對氯醌的甲苯飽和溶液，以及小刮刀一端大小的樹脂樣品，然后渦旋混合物，并在室溫下靜置5分鐘。丙酮用于檢測仲胺，乙醛用于檢測伯胺。

持續肽延伸

一旦氨基酸的偶聯完成，就洗滌樹脂，用哌啶去保護Fmoc基團，并再次洗滌樹脂，為下一次偶聯做準備。重復這一過程，直到添加完所有必需的氨基酸。

乙酰化N-末端

肽序列完成后，可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙酰化N-末端胺1小時或直到茚三酮陰性，然后用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹脂，然后將肽從樹脂上切下。如果需要，N-末端也可以作為游離胺留下。

從樹脂上切割肽

用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基硅烷(TIPS)和水(H2O)處理樹脂，每次處理10分鐘，然后過濾掉樹脂，將合并的濾液靜置1小時，以確保除去酸不穩定的保護基團。

從樹脂上切割后肽的處理

將TFA在旋轉蒸發器上蒸發至干(或重油或玻璃，如果它不凝固的話)，隨后向燒瓶中加入5 ml*醚以沉淀肽，并除去大部分副產物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中，并以3000 rpm的速度旋轉10-20分鐘(IEC離心機),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的后，通過渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物，倒出，洗滌過程重復兩次以上。最后，產品可以在脫粘器中的Falcon管中風干過夜。

通常使用制備型HPLC來純化最終產物。獲得質譜數據以確保獲得目標肽。