jenabioscience:Atto425 NT Labeling Kit  貨號：PP-305L-425

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業客戶開發創新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避免冷凍/解凍循環，避光儲存

保質期:12個月

光譜特性: λexc436納米，λ全身長的484納米，ε 45.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)

描述:
Atto425缺口翻譯標記試劑盒包含缺口翻譯標記所需的所有試劑(除了用于純化探針的模板和材料),提供了一種高效、易于實施和快速的標記技術。
該試劑盒被推薦用于DNA的直接酶標記。Atto425 NT標記混合物包含經過特別優化的Atto425-dUTP，可通過DNA聚合酶I進行缺口翻譯，從而整合到DNA中。熒光團出色的穩定性和量子產率，加上染料-dUTP復合物的高整合率，使其成為各種熒光應用的理想選擇。
缺口翻譯標記基于聚合酶I和脫氧核糖核酸酶I的反向活性。脫氧核糖核酸酶I能夠在低酶濃度下將隨機分布的缺口引入雙鏈DNA。聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性從缺口的3’側去除核苷酸，同時使用3’-OH末端作為引物合成部分新的互補鏈。在存在染料標記的dUTP聚合酶的情況下，I摻入標記的dUTP而不是dTTP。酶混合物中平衡良好的聚合酶/核酸酶活性確保了高度標記的雙鏈DNA片段的產生。
所得DNA適用于FISH、微陣列基因表達譜和其他核酸雜交分析。
保護熒光標記的dUTP免受光照射，并在弱光條件下進行實驗程序。

內容:
酶混合物(紅色瓶蓋)
儲存緩沖液中的2單位/微升聚合酶I和0.02單位/微升脫氧核糖核酸酶I

NT標記緩沖液(綠色瓶蓋)
10倍濃度

Atto425 NT標簽混合物(紫色瓶蓋)
0.5毫米dATP、0.5毫米dCTP、0.5毫米dGTP、0.25毫米dTTP、
0.25毫米Atto425-dUTP，pH 7.5

停止緩沖器(黃色蓋子)
0.5 M EDTA，pH 8.0

PCR級水(白色瓶蓋)

推薦的NT檢測:
樣品材料可以是超螺旋或線性化的質粒DNA、粘粒或BAC DNA、完整或部分染色體或純化的PCR產物。
在無菌小瓶中制備以下反應混合物。
20 μl缺口翻譯標記分析

• 輕輕渦旋混合物以確保均勻，并短暫離心以收集試管底部的反應混合物。
• 將試管置于15°c預冷的熱混合器中。建議孵育90分鐘，以產生大小在200和500 bp之間的DNA片段。
• 為了控制片段的長度，在瓊脂糖凝膠上加載2 μl分析物。運行凝膠時，將反應管置于-20°C。
• 為了獲得更小的片段，添加額外的2 μl酶混合物，并在15℃下延長孵育時間
• 為最終終止反應，添加5 μl終止緩沖液(黃色瓶蓋)。進行純化或儲存在-20°c下

探針的純化:
為了在反應混合物用于后續實驗之前從反應混合物中除去未摻入的核苷酸，建議采用以下程序之一:
1.硅膠膜吸附純化- PCR純化試劑盒。不，第201頁
Jena Bioscience PCR純化試劑盒提供了一種簡單有效的方法來純化大于100 bp的DNA片段。該制劑基于二氧化硅膜技術，用于在高鹽中結合DNA，并在低鹽緩沖液中洗脫。請參考說明書。
2.異丙醇沉淀提純
向反應混合物中加入1 μl糖原(2 mg/ml)、2 μl乙酸鈉(3 M)和14 μl異丙醇，并輕輕充分混合。室溫下孵育15分鐘，并在4℃下以最大速度旋轉30分鐘。棄去上清液，用70 %乙醇洗滌2次(以最大速度旋轉5分鐘)。
3.離心過濾裝置凈化
未摻入的核苷酸可以用離心過濾裝置通過離心去除。根據DNA片段的截止值選擇過濾器裝置，并遵循制造商的說明。

熒光團的摻入率:
DNA標記的效率可以通過計算摻入的熒光團與片段中堿基數量的比率(染料/堿基)來估計。
1.光密度的測量:測量標記的DNA片段在260 nm處的吸光度(A260)和激發最大值(λexc)為染料(A給…染色).
2.A的校正260閱讀:為了獲得核酸的精確吸光度測量，必須校正260 nm處染料的貢獻。使用以下等式:
A基礎= A260-(答給…染色x CF260)
Atto425的校正系數:CF260 = 0.27
3.標記率的計算:染料與堿的比例由下式給出:
染料/堿= (A給…染色x ε基礎)/ (A基礎x ε給…染色)
消光系數:
Atto425: ε給…染色= 45000厘米-1 M-1
dsDNA: ε基礎= 6600厘米-1 M-1
ssDNA: ε基礎= 8900厘米-1 M-1
寡核苷酸:ε堿基= 10000cm-1 M-1
實施例:染料與堿基之比為0.05對應于將10個dye-dUTP核苷酸分別摻入到含有200個核苷酸的DNA片段中，或者摻入到100 bp的PCR片段中。如果可以假設dATP、dCTP、dGTP和dTTP在DNA片段中的平均分布，50個現有dttp中的10個已經被dye-dUTP取代，導致20 %的標記率。

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